[صفحه اصلی ]   [Archive] [ English ]  
:: صفحه اصلي :: درباره نشريه :: آخرين شماره :: تمام شماره‌ها :: جستجو :: ثبت نام :: ارسال مقاله ::
:: دوره 10، شماره 2 - ( بهار 1401 ) ::
دوره 10 شماره 2 صفحات 148-133 برگشت به فهرست نسخه ها
پروتکل وسترن بلاتینگ و چالش های آن
جواد مومنی، سجاد سحاب نگاه*
الف. مرکز تحقیقات علوم اعصاب، دانشگاه علوم پزشکی مشهد، مشهد، ایران. ب. مرکز تحقیقات علوم اعصاب شفا، بیمارستان خاتم‌الانبیاء، تهران، ایران ، sahabnegahs@mums.ac.ir
چکیده:   (418 مشاهده)
مقدمه: تشخیص بیان پروتئین در بافت‌ها و سلول‌های عصبی برای آزمایشگاه‌های مدرن علوم اعصاب و آزمایشگاه‌هایی که رویکردهای تشخیصی را انجام می‌دهند ضروری است. بدین منظور، ما یک مقاله مروری جامع در مورد مراحل و چالش‌های وسترن بلات (WB) جمع آوری کردیم. WB نتایج کیفی خوبی برای تعیین محتوای پروتئین هدف در یک نمونه ارائه می‌دهد و به‌ویژه برای تجزیه و تحلیل پروتئین‌های نامحلول مفید است. این فرآیند را می‌توان به‌طور کلی به پنج مرحله تقسیم کرد: 1. استخراج پروتئین، 2. الکتروفورز، 3. انتقال غشا، 4. ایمونودیتکشن، و 5. ظهور و تجزیه و تحلیل. این فرایندها شامل انتقال الگوهای پروتئینی از ژل به غشایی با منافذ ریز است. انتقال پروتئین و به‌دنبال آن ایمونودیتکشن ابزاری عالی برای شناسایی بسیاری از پروتئین‌ها است، به‌ویژه پروتئین‌هایی که فراوانی کمتری دارند. انتقال کارآمد پروتئین‌ها از یک ژل به یک غشاء جامد و ایمونودیتکشن خاص تا حد زیادی به پارامترهای مختلف بستگی دارد. نتیجه‌گیری: برای کاهش چالش‌ها و افزایش آگاهی نسبت به تغییرات جدید در WB، این مقاله مروری، نمایی از روش‌ها، مواد و دستگاه ها در روش WB را فراهم می‌آورد.
واژه‌های کلیدی: علوم اعصاب، آزمایشگاه‌ها، ایمونوبلاتینگ
متن کامل [PDF 2990 kb]   (162 دریافت)    
نوع مطالعه: مروری | موضوع مقاله: تحقیقات پایه در علوم اعصاب
attachement [PDF 1149 KB]  (10 دریافت)
فهرست منابع
1. Southern EM. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J Mol Biol. 1975; 98(3): 503-17. [DOI:10.1016/S0022-2836(75)80083-0]
2. Alwine JC, Kemp DJ, Stark GR. Method for detection of specific RNAs in agarose gels by transfer to diazobenzyloxymethyl-paper and hybridization with DNA probes. Proc Natl Acad Sci U S A. 1977; 74(12): 5350-4. [DOI:10.1073/pnas.74.12.5350]
3. Burnette WN. "Western blotting": electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Anal Biochem. 1981; 112(2): 195-203. [DOI:10.1016/0003-2697(81)90281-5]
4. Towbin H, Staehelin T, Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1979; 76(9): 4350-4. [DOI:10.1073/pnas.76.9.4350]
5. Bass JJ, Wilkinson DJ, Rankin D, Phillips BE, Szewczyk NJ, Smith K, et al. An overview of technical considerations for Western blotting applications to physiological research. Scandinavian Journal of Medicine & Science in Sports. 2017; 27(1): 4-25. [DOI:10.1111/sms.12702]
6. Jalali Kondori B, Asadi MH, Azemati F. Subcloning of NGF Gene into pSecTag2/Hygro Secretory Vector and Expression in PC12 Cell Line. The Neuroscience Journal of Shefaye Khatam. 2015; 3(1): 21-8. [DOI:10.18869/acadpub.shefa.3.1.21]
7. Mehrabi A, Gaeini A, Nouri R, Daryanoosh F. The Effect of Six-Week HIIT Swimming Exercise and Resveratrol Supplementation on the Level of SIRT3 in Frontal Lobe of Aged Rats. The Neuroscience Journal of Shefaye Khatam. 2021; 9(2): 48-59. [DOI:10.52547/shefa.9.2.48]
8. Najmi Z, Ghasemi S, Ghalandari R, Sotoudehnejad Nematalahi F. Production and Evaluation of Anti-Mouse Polyclonal Antibody Against Enterotoxin B of Staphylococcus Aurous. The Neuroscience Journal of Shefaye Khatam. 2020; 8(2): 82-92. [DOI:10.29252/shefa.8.2.82]
9. Li R, Shen Y. An old method facing a new challenge: re-visiting housekeeping proteins as internal reference control for neuroscience research. Life Sci. 2013; 92(13): 747-51. [DOI:10.1016/j.lfs.2013.02.014]
10. Carter M, Shieh JC. Chapter 14 - Biochemical Assays and Intracellular Signaling. In: Carter M, Shieh JC, editors. Guide to Research Techniques in Neuroscience. New York: Academic Press; 2010. p. 297-329. [DOI:10.1016/B978-0-12-374849-2.00014-8]
11. Doumas BT, Bayse DD, Carter RJ, Peters T, Jr., Schaffer R. A candidate reference method for determination of total protein in serum. I. Development and validation. Clin Chem. 1981; 27(10): 1642-50. [DOI:10.1093/clinchem/27.10.1642]
12. Mahmood T, Yang P-C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. N Am J Med Sci. 2012; 4(9): 429-34. [DOI:10.4103/1947-2714.100998]
13. Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 1976; 72: 248-54. [DOI:10.1016/0003-2697(76)90527-3]
14. Desjardins P, Hansen JB, Allen M. Microvolume protein concentration determination using the NanoDrop 2000c spectrophotometer. JoVE (Journal of Visualized Experiments). 2009; (33): e1610. [DOI:10.3791/1610]
15. Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970; 227(5259): 680-5. [DOI:10.1038/227680a0]
16. Anfinsen CB. Principles that govern the folding of protein chains. Science. 1973; 181(4096): 223-30. [DOI:10.1126/science.181.4096.223]
17. Krieg RC, Dong Y, Schwamborn K, Knuechel R. Protein quantification and its tolerance for different interfering reagents using the BCA-method with regard to 2D SDS PAGE. J Biochem Biophys Methods. 2005; 65(1): 13-9. [DOI:10.1016/j.jbbm.2005.08.005]
18. Smith BJ. SDS Polyacrylamide Gel Electrophoresis of Proteins. Methods Mol Biol. 1984; 1: 41-55. [DOI:10.1385/0-89603-062-8:41]
19. Taylor SC, Posch A. The design of a quantitative western blot experiment. Biomed Res Int. 2014; 2014: 361590. [DOI:10.1155/2014/361590]
20. Weber K, Osborn M. The reliability of molecular weight determinations by dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. J Biol Chem. 1969; 244(16): 4406-12. [DOI:10.1016/S0021-9258(18)94333-4]
21. Ornstein L. DISC ELECTROPHORESIS. I. BACKGROUND AND THEORY. Ann N Y Acad Sci. 1964; 121: 321-49. [DOI:10.1111/j.1749-6632.1964.tb14207.x]
22. Chrambach A, Rodbard D. Polyacrylamide gel electrophoresis. Science. 1971; 172(3982): 440-51. [DOI:10.1126/science.172.3982.440]
23. Rath A, Cunningham F, Deber CM. Acrylamide concentration determines the direction and magnitude of helical membrane protein gel shifts. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013; 110(39): 15668-73. [DOI:10.1073/pnas.1311305110]
24. Warren CM, Krzesinski PR, Greaser ML. Vertical agarose gel electrophoresis and electroblotting of high-molecular-weight proteins. Electrophoresis. 2003; 24(11): 1695-702. [DOI:10.1002/elps.200305392]
25. Walker JM. Gradient SDS polyacrylamide gel electrophoresis of proteins. Methods Mol Biol. 1994; 32: 35-8. [DOI:10.1385/0-89603-268-X:35]
26. Kurien BT, Scofield RH. Western blotting. Methods. 2006; 38(4): 283-93. [DOI:10.1016/j.ymeth.2005.11.007]
27. MacPhee DJ. Methodological considerations for improving Western blot analysis. J Pharmacol Toxicol Methods. 2010; 61(2): 171-7. [DOI:10.1016/j.vascn.2009.12.001]
28. Matsudaira P. Sequence from picomole quantities of proteins electroblotted onto polyvinylidene difluoride membranes. J Biol Chem. 1987; 262(21): 10035-8. [DOI:10.1016/S0021-9258(18)61070-1]
29. Mansfield MA. Rapid immunodetection on polyvinylidene fluoride membrane blots without blocking. Anal Biochem. 1995; 229(1): 140-3. [DOI:10.1006/abio.1995.1391]
30. Mozdzanowski J, Hembach P, Speicher DW. High yield electroblotting onto polyvinylidene difluoride membranes from polyacrylamide gels. Electrophoresis. 1992; 13(1-2): 59-64. [DOI:10.1002/elps.1150130112]
31. Towbin H, Staehelin T, Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 1979; 76(9): 4350-4. [DOI:10.1073/pnas.76.9.4350]
32. Colella AD, Chegenii N, Tea MN, Gibbins IL, Williams KA, Chataway TK. Comparison of Stain-Free gels with traditional immunoblot loading control methodology. Anal Biochem. 2012; 430(2): 108-10. [DOI:10.1016/j.ab.2012.08.015]
33. Kurien BT, Danda D, Bachmann MP, Scofield RH. SDS-PAGE to Immunoblot in One Hour. Methods Mol Biol. 2015; 1312: 449-54. [DOI:10.1007/978-1-4939-2694-7_45]
34. Jensen EC. The basics of western blotting. The Anatomical Record: Advances in Integrative Anatomy and Evolutionary Biology. 2012; 295(3): 369-71. [DOI:10.1002/ar.22424]
35. Spinola SM, Cannon JG. Different blocking agents cause variation in the immunologic detection of proteins transferred to nitrocellulose membranes. Journal of immunological methods. 1985; 81(1): 161-5. [DOI:10.1016/0022-1759(85)90132-2]
36. Gershoni JM, Palade GE. Protein blotting: principles and applications. Analytical biochemistry. 1983; 131(1): 1-15. [DOI:10.1016/0003-2697(83)90128-8]
37. Kurien BT, Dorri Y, Dillon S, Dsouza A, Scofield RH. An overview of Western blotting for determining antibody specificities for immunohistochemistry. Signal Transduction Immunohistochemistry. 2011: 55-67. [DOI:10.1007/978-1-61779-024-9_3]
38. Lipman NS, Jackson LR, Trudel LJ, Weis-Garcia F. Monoclonal versus polyclonal antibodies: distinguishing characteristics, applications, and information resources. ILAR journal. 2005; 46(3): 258-68. [DOI:10.1093/ilar.46.3.258]
39. Voller A, Bartlett A, Bidwell D. Enzyme immunoassays with special reference to ELISA techniques. Journal of clinical pathology. 1978; 31(6): 507-20. [DOI:10.1136/jcp.31.6.507]
40. Miura T, Suzuki W, Ishihara E, Arai I, Ishida H, Seino Y, et al. Impairment of insulin-stimulated GLUT4 translocation in skeletal muscle and adipose tissue in the Tsumura Suzuki obese diabetic mouse: a new genetic animal model of type 2 diabetes. European journal of endocrinology. 2001; 145(6): 785-90. [DOI:10.1530/eje.0.1450785]
41. Crossland H, Kazi AA, Lang CH, Timmons JA, Pierre P, Wilkinson DJ, et al. Focal adhesion kinase is required for IGF-I-mediated growth of skeletal muscle cells via a TSC2/mTOR/S6K1-associated pathway. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 2013. [DOI:10.1152/ajpendo.00541.2012]
42. Bronstein I, Voyta J, Thorpe G, Kricka L, Armstrong G. Chemiluminescent assay of alkaline phosphatase applied in an ultrasensitive enzyme immunoassay of thyrotropin. Clinical chemistry. 1989; 35(7): 1441-6. [DOI:10.1093/clinchem/35.7.1441]
43. Kricka LJ. Chemiluminescent and bioluminescent techniques. Clinical chemistry. 1991; 37(9): 1472-81. [DOI:10.1093/clinchem/37.9.1472]
44. Babson AL, Greeley SJ, Coleman CM, Phillips GE. Phenolphthalein monophosphate as a substrate for serum alkaline phosphatase. Clinical chemistry. 1966; 12(8): 482-90. [DOI:10.1093/clinchem/12.8.482]
45. Alegria-Schaffer A, Lodge A, Vattem K. Performing and optimizing Western blots with an emphasis on chemiluminescent detection. Methods in enzymology. 2009; 463: 573-99. [DOI:10.1016/S0076-6879(09)63033-0]
46. Argentieri MC, Pilla D, Vanzati A, Lonardi S, Facchetti F, Doglioni C, et al. Antibodies are forever: a study using 12-26‐year‐old expired antibodies. Histopathology. 2013; 63(6): 869-76. [DOI:10.1111/his.12225]


XML   English Abstract   Print


Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:

Momeni J, Sahab Negah S. Western Blotting Protocol and its Troubleshooting. Shefaye Khatam. 2022; 10 (2) :133-148
URL: http://shefayekhatam.ir/article-1-2241-fa.html

مومنی جواد، سحاب نگاه سجاد. پروتکل وسترن بلاتینگ و چالش های آن. مجله علوم اعصاب شفای خاتم. 1401; 10 (2) :148-133

URL: http://shefayekhatam.ir/article-1-2241-fa.html



بازنشر اطلاعات
Creative Commons License این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است.
دوره 10، شماره 2 - ( بهار 1401 ) برگشت به فهرست نسخه ها
مجله علوم اعصاب شفای خاتم The Neuroscience Journal of Shefaye Khatam
Persian site map - English site map - Created in 0.05 seconds with 29 queries by YEKTAWEB 4463